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Nanopore納米孔測序技術(shù)

更新時間:2020-02-28      點(diǎn)擊次數(shù):2818

      納米孔測序技術(shù)如今飛速發(fā)展。以Nanopore納米測序儀為例,它在Nanopore芯片的基質(zhì)上錨定一個“孔道蛋白”,該蛋白可以和“motor蛋白”結(jié)合。“motor蛋白”可以將DNA雙螺旋解開成單鏈,并控制單鏈通過“孔道蛋白”。當(dāng)DNA單分子穿過“孔道蛋白”時,不同的堿基會帶來不同的電流變化,孔道中的感受器能夠感知這種變化。根據(jù)電流變化的頻譜,應(yīng)用模式識別算法得到堿基序列
(圖1)。

圖1 納米孔測序原理示意圖。DNA分子被motor蛋白解螺旋后通過孔道蛋白,產(chǎn)生電流變化。

     儀器特點(diǎn):
• 實時讀取堿基序列,不需要后期集中對測序信號進(jìn)行二次解讀
• DNA/RNA直接測序,RNA不需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄再測序
• 超長讀長,可以達(dá)到“M bp”級別
• 高保真度,因為不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增,避免了引入突變
• 可以檢測堿基修飾
      特點(diǎn)展示1:實時測序
    “Motor蛋白”有兩個作用,一個是將捕獲的DNA分子進(jìn)行解螺旋,變成單鏈分子;另一個是控制單鏈分子進(jìn)入納米孔的速度。當(dāng)DNA分子上不同的堿基通過納米孔時,會產(chǎn)生不同的電流變化,這種變化被實時記錄下來,然后快速進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索和匹配,從而解析出對應(yīng)的堿基類型(圖2)。目前的測序速度可以達(dá)到,DNA 450bp/秒,RNA 70nt/秒。

圖2 納米孔測序儀對堿基序列的實時解讀。

      特點(diǎn)展示2:納米孔測序直接解讀RNA中修飾核苷酸
      傳統(tǒng)的rRNA基因或rRNA cDNA拷貝的高通量測序(二代測序,方法是SBS)已廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究和臨床鑒定傳染性生物。然而,通過“邊合成邊測序(SBS)”的方法移除了rRNA的表觀遺傳修飾信息。納米孔測序的一個顯著優(yōu)勢,是可對天然DNA和RNA進(jìn)行直接分析并解析堿基修飾。這種直接RNA測序技術(shù)有望快速鑒定環(huán)境和患者樣本中的微生物。

圖3 納米孔測序儀直接測序RNA。RNA修飾可以作為微生物鑒定的指標(biāo),同時納米孔測序儀的長讀長可以幫助提高分類準(zhǔn)確性。

      應(yīng)用領(lǐng)域:
      納米孔測序儀憑借其超長讀長、便捷的建庫、實時測序、能進(jìn)行表觀遺傳分析等諸多優(yōu)點(diǎn),在測序領(lǐng)域逐漸得到廣泛的應(yīng)用。目前,在微生物耐藥性/致病性,微生物宏基因組,人類遺傳學(xué)研究,癌癥研究,轉(zhuǎn)錄組分析等領(lǐng)域,Nanopore測序儀正帶來越來越多的研究成果。
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